Un conjunto de herramientas de ensamblaje de ADN para desbloquear el potencial de CRISPR/Cas9 para la ingeniería metabólica

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 858 (2023) Citar este artículo

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Las tecnologías basadas en CRISPR/Cas9 están revolucionando la forma en que diseñamos células microbianas. Una de las ventajas clave de CRISPR en el diseño de cepas es que permite la integración cromosómica de ADN libre de marcadores, eliminando procedimientos de recuperación de marcadores laboriosos y a menudo ineficientes. A pesar de los beneficios, ensamblar sistemas de edición CRISPR/Cas9 todavía no es un proceso sencillo, lo que puede impedir su uso y aplicaciones. En este trabajo, hemos identificado algunas de las principales limitaciones de los kits de herramientas Cas9 actuales y hemos diseñado mejoras con el objetivo de facilitar el acceso y la implementación de las tecnologías CRISPR. Estos incluyen 1) un sistema para cambiar rápidamente entre construcciones de integración sin marcadores y basadas en marcadores utilizando cepas de Escherichia coli estándar y que expresan Cre, 2) la capacidad de redirigir casetes de integración multigénica a loci genómicos alternativos a través del intercambio basado en Golden Gate de brazos de homología, 3) un método in vivo rápido y simple para ensamblar secuencias de ARN guía mediante la recombinación entre plásmidos auxiliares Cas9 y oligonucleótidos individuales. Combinamos estas metodologías con tecnologías bien establecidas en un conjunto de herramientas integral para una ingeniería metabólica eficiente utilizando CRISPR/Cas9. Como prueba de concepto, desarrollamos el kit de herramientas YaliCraft para Yarrowia lipolytica, que se compone de un conjunto básico de 147 plásmidos y 7 módulos con diferentes propósitos. Utilizamos el kit de herramientas para generar y caracterizar una biblioteca de 137 promotores y construir una cepa de novo que sintetice 373,8 mg/l de ácido homogentísico.

El desarrollo de tecnologías basadas en CRISPR/Cas9 ha permitido modificaciones genómicas rápidas, precisas y sin cicatrices, lo que muestra un gran potencial para el diseño y la bioproducción de cepas microbianas. En particular, la ingeniería metabólica de levaduras es una de las áreas de más rápido crecimiento en ingeniería biológica, permitiendo la producción sostenible de productos químicos, combustibles, materiales, alimentos y productos farmacéuticos1. Si bien tienen el gran potencial metabólico de las células eucariotas, debido a su naturaleza unicelular y su rápido crecimiento, las levaduras son más fáciles de diseñar y cultivar a escala.

Por ello, se han desarrollado sistemas CRISPR para levaduras2,3,4. Una de las ventajas más importantes de CRISPR es que, debido a su alta eficiencia, permite modificaciones genómicas sin marcadores. Durante la ingeniería de cepas tradicional, la eliminación de marcadores seleccionables del genoma, conocida como recuperación de marcadores, es un cuello de botella común5. Incluso los cultivos de levadura de rápido crecimiento requieren al menos cinco días para la recuperación del marcador6, mientras que la transformación integrativa en sí requiere sólo dos o tres. Por lo tanto, en los últimos años se han desarrollado varias técnicas de integración sin marcadores facilitadas por CRISPR6,7,8,9. A pesar de estos avances, muchos proyectos actuales de ingeniería metabólica todavía dependen de enfoques basados en marcadores, lo que puede limitar o retrasar el éxito en la optimización de la cepa. En este trabajo, hemos identificado 3 mejoras de los sistemas CRISPR/Cas9 que pueden facilitar el uso de la ingeniería de levadura basada en Cas9, (1) el fácil intercambio entre modificaciones con marcador y sin marcador (2) el intercambio rápido de brazos de homología para apuntar a diferentes integraciones ubicaciones y (3) un método sencillo para clonar gRNA.

Durante la integración libre de marcadores basada en CRISPR, el único factor selectivo es la rotura de doble cadena (DSB) inducida por Cas9. Para proliferar, las células necesitan reparar esta lesión. Esto puede suceder mediante el uso de una plantilla (donante) que se integra mediante recombinación homóloga (HR) o mediante unión de extremos no homóloga (NHEJ), es decir, sin integración. La actividad NHEJ se observa en la mayoría de las especies de hongos, incluida la levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae5,10. En especies donde NHEJ es el mecanismo predominante, una estrategia común para mejorar la HR es eliminar los genes NHEJ (KU70, KU80, POL4 y DNL4)11. Esta estrategia, si bien mejora los recursos humanos, no previene por completo la actividad no deseada del NHEJ12. Por lo tanto, el aislamiento de transformantes con modificaciones que conducen a fenotipos de crecimiento lento representa un problema general con los enfoques de integración sin marcadores. Esto se debe a que los mutantes indel producidos por NHEJ pueden crecer demasiado y enmascarar transformantes integrativos raros y de crecimiento lento. Aunque rara vez se publican esfuerzos de ingeniería fallidos, hay un ejemplo relacionado con la alteración del gen SDH5 en Yarrowia lipolytica. A pesar de múltiples intentos, esta modificación no se aisló mediante una estrategia sin marcadores basada en CRISPR13, mientras que la eliminación exitosa se obtuvo utilizando un marcador auxotrófico14. Observaciones similares son muy comunes en los trabajos de ingeniería de levaduras, donde a menudo algunos loci son más fáciles de modificar que otros, y algunos no tienen éxito, en parte debido a la dificultad para seleccionar productos de crecimiento lento. Este tipo de mutaciones con efectos nocivos sobre el crecimiento celular son frecuentes en la ingeniería metabólica15. Los estudios de todo el genoma de S. cerevisiae revelaron que la sobreexpresión del 20% de los genes16 y la alteración del 15% de los genes no esenciales17 afectan negativamente el crecimiento celular. Además, la viabilidad celular puede verse afectada negativamente por interacciones epistáticas entre modificaciones en genes no alélicos18. Por lo tanto, los enfoques de ingeniería basados en la integración sin marcadores pueden implicar casos ocasionales (pero difíciles de predecir) en los que se necesita una selección estricta basada en un marcador auxotrófico. En estos casos, sería necesario volver a montar un nuevo casete, lo que retrasaría significativamente el progreso. Por lo tanto, una mejora deseada en los sistemas de integración asistidos por CRISPR/Cas9 sería un método para volver fácilmente a la integración basada en marcadores cuando falla el intento sin marcadores.

La integración asistida por Cas9 requiere una plantilla de donante que consta de un casete de integración flanqueado por dos brazos de homología (HA). Cada par de HA se dirige a un locus genómico único y solo se pueden usar una vez en una cepa determinada para la sobreexpresión de un número limitado de unidades de transcripción (TU). A medida que avanza la biología sintética, aumenta el número promedio de modificaciones por cepa. Por tanto, el número de sitios genómicos adecuados para la integración homóloga debe crecer en paralelo. En consecuencia, se han desarrollado conjuntos de vectores donantes listos para usar con diferentes HA para la mayoría de las levaduras industrialmente relevantes, como S. cerevisiae19, Ogataea polymorpha20, Kluyveromyces marxianus21, Komagataella phaffii22 e Y. lipolytica9. La aplicación del conjunto Golden Gate (GG) de un solo recipiente permite un sistema eficiente para construir varias TU en el vector de rodamiento requerido HA23. Sin embargo, cambiar los HA de un casete de integración construido generalmente retrasa el progreso de la ingeniería, porque a menudo implica la generación de un nuevo casete desde cero o el uso de técnicas de clonación menos convenientes, como la ligadura de restricción o el ensamblaje de Gibson. Ser capaz de redirigir fácilmente una construcción donante preensamblada a un lugar de integración alternativo aceleraría los enfoques de ingeniería metabólica. Además, permitiría la integración de múltiples copias de una TU en todo el genoma y brindaría la oportunidad de sustituir una construcción por otra en un locus particular. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que un sistema de integración mediado por CRISPR/Cas9 ideal debería poseer la capacidad de intercambiar HA en construcciones donantes de Cas9 preensambladas, utilizando una reacción GG simplificada.

A diferencia de otras técnicas, la integración mediada por CRISPR/Cas9 requiere diseñar, ensamblar y transformar una construcción adicional que exprese una secuencia de ARNg variable. Un enfoque común y eficiente combina ambos elementos genéticos, Cas9 y gRNA, en el mismo episomal auxiliar, lo que garantiza su expresión transitoria después de la cotransformación con un donante24. Para redirigir el evento de corte y recombinación a una nueva posición, solo es necesario cambiar 20 bases de la secuencia del ARNg. Se han utilizado varias técnicas de ensamblaje con ese propósito, incluida la clonación USER9, el ensamblaje GG25 y los enfoques sin clonación26. Además, se ha desarrollado un método alternativo reciente y eficaz para modificar un ARNg situado en el cromosoma de Escherichia coli27, que consiste en utilizar recombinación y un único oligonucleótido de 90 bases que alberga los 20 nucleótidos específicos en el medio de la secuencia. Aunque la recombinación no es eficaz en eucariotas, el plásmido auxiliar necesario puede potencialmente ensamblarse mediante un paso rápido en E. coli. Creemos que la implementación de un método rápido de recodificación de ARNg mediante recombinación podría beneficiar a los sistemas de integración asistidos por CRISPR/Cas9.

Un elemento clave de cualquier proyecto de ingeniería metabólica son los promotores, que permiten la regulación de las redes metabólicas para redirigir el flujo hacia los productos deseados28. La mayoría de los kits de herramientas de biología sintética de levaduras comprenden una serie de promotores caracterizados. Sin embargo, en muchas levaduras no convencionales, NHEJ es fuerte y el uso de técnicas basadas en marcadores para caracterizar promotores puede ser inexacto ya que la integración aleatoria puede conducir a múltiples eventos de integración11,29,30. Al mismo tiempo, lo ideal es que la caracterización de nuevos promotores se realice en un contexto genético estandarizado, es decir, como una integración de una sola copia en una posición definida del genoma. Esto puede ser facilitado por DSB mediados por CRISPR, conocidos por mejorar la integración más de 1000 veces2,31. Por lo tanto, la incorporación de métodos de caracterización de promotores basados en CRISPR sería beneficiosa para muchos sistemas de levadura y facilitaría los ensayos fáciles y rápidos de grandes bibliotecas de promotores. Además, permitirá una mejor comparación de las potencias de los promotores entre laboratorios.

Aquí, utilizando la levadura industrial Y. lipolytica como ejemplo, hemos desarrollado un conjunto de herramientas modular de ingeniería metabólica (YaliCraft) que combina estrategias bien establecidas de edición de genes y ensamblaje de ADN con métodos recientemente implementados para abordar los cuatro conceptos descritos anteriormente, que mostraron una alta eficiencia. y versatilidad (Fig. 1).

El conjunto de herramientas consta de siete módulos para el ensamblaje rápido y sencillo de construcciones integradoras y plásmidos auxiliares Cas9. Módulo Lvl0: piezas individuales en vectores de entrada. Módulo Exp: ensamblaje de constructos de sobreexpresión. Módulo Pro: montaje y proyección de nuevos promotores. Módulo Del: ensamblaje de constructos de disrupción. Módulo Int: cambio de loci de integración mediante intercambio de armas por homología. Módulo MEx: ensamblaje de construcciones sin marcadores mediante escisión de marcadores seleccionables. Módulo Cas: redirección de Cas9-helper a nuevos loci del genoma. Cinco de los módulos (módulos Pro, Del, Cas, Int y MEx) representan una nueva metodología que amplía funcionalmente los sistemas de ensamblaje GG utilizados anteriormente. El ensamblaje de los módulos Pro, Del e Int se basa en reacciones GG únicas, mientras que los módulos Cas y MEx implican una recombinación homóloga y específica de sitio que tiene lugar en cepas especiales de E. coli. Las flechas entre los módulos indican diferentes órdenes en los que se pueden aplicar para permitir técnicas de ingeniería del genoma variable, como se muestra en el panel superior, Levadura. La Tabla complementaria 8 es una lista de los principales plásmidos del conjunto de herramientas.

Y. lipolytica, es una levadura oleaginosa con alta capacidad de bioproducción que está atrayendo una importante atención por parte de la industria32. Y. lipolytica, como la mayoría de las levaduras no convencionales, muestra una capacidad de HR limitada y, por tanto, el uso de la integración mediada por CRISPR/Cas9 ha demostrado ser eficaz33,34,35. Debido a la relevancia de esta levadura, se han desarrollado varios kits de herramientas modulares para este organismo9, 36,37,38,39,40,41, aunque ninguno de ellos aborda directamente las cuestiones descritas anteriormente.

Presentamos aquí el kit de herramientas YaliCraft, descrito íntegramente en un detallado manual de 44 páginas (Material complementario), que está formado por siete módulos que se pueden aplicar en diferentes combinaciones y que permiten la sobreexpresión o disrupción de genes, la redirección de gRNA y donante, el ensamblaje simultáneo de donantes con y sin marcador, así como la selección de grandes bibliotecas de promotores, haciéndolos inmediatamente disponibles para sobreexpresiones de genes. Para demostrar la utilidad del sistema CRISPR/Cas9 desarrollado, caracterizamos el conjunto de promotores más grande jamás descrito en Y. lipolytica y diseñamos una cepa que produce altos títulos de ácido homogentísico (HGA) de novo a partir de glucosa.

Para desbloquear todo el potencial de la tecnología CRISPR/Cas9 para la ingeniería metabólica, desarrollamos un conjunto de herramientas con una estructura basada en 7 módulos individuales que amplía los sistemas de ensamblaje GG previamente conocidos23,36,37,42. Mantuvimos la sintaxis de los kits de herramientas de Yarrowia anteriores para facilitar el intercambio de piezas compatibles36,37 e implementamos una estructura jerárquica basada en el kit de herramientas de levadura ampliamente utilizado23. Cada módulo comprende un tipo específico de operación molecular modificando el vector final. Dichas operaciones son una reacción GG en un solo recipiente in vitro o una recombinación in vivo en E. coli. Cada paso requiere dos días para preparar construcciones para el siguiente paso de modificación o para la transformación de la levadura (Tabla complementaria 1). Algunas operaciones, por ejemplo, el montaje del GG y la escisión del marcador, se pueden combinar en un solo paso. Los módulos han sido diseñados para usarse en diferentes órdenes y combinaciones que permiten el máximo grado de libertad, al mismo tiempo que simplifican la cantidad de pasos necesarios para obtener la construcción deseada (Fig. 1 o Fig. 1 complementaria).

El módulo Lvl0 (nivel 0) está formado por una colección de elementos genéticos individuales, que se pueden ampliar fácilmente. En el módulo Exp (Expresión), estas partes se pueden combinar en una variedad de vectores de sobreexpresión integradores con las combinaciones deseadas de promotores, genes, terminadores, HA y marcadores seleccionables. El Módulo Pro (Promoter) permite la caracterización de nuevos promotores en levadura y es totalmente compatible con el Módulo Exp. El módulo Del (Deletion) permite el ensamblaje en un solo paso de construcciones basadas en marcadores para alteraciones genéticas. El módulo Int (Integración) implementa la redirección rápida de construcciones de sobreexpresión preensambladas a loci del genoma alternativo mediante el intercambio de HA. El módulo MEx (Marker Excision) fue diseñado para permitir la generación de una versión sin marcadores de cualquier construcción de integración utilizando un host de ensamblaje específico EcoCre. El módulo Cas separado admite el ensamblaje simplificado basado en recombinación de ayudantes de Cas9 utilizando el host de ensamblaje EcoRed. Los ayudantes obtenidos pueden cortar el genoma de la levadura en cualquier posición definida, lo que permite una integración sin marcadores.

Para verificar la funcionalidad y compatibilidad de estos módulos, hemos preparado un conjunto de herramientas de ejemplo inicial para la ingeniería metabólica de Y. lipolytica. El conjunto básico comprende 147 plásmidos, dos cepas de E. coli y tres de Y. lipolytica (tablas complementarias 8 y 9), que estarán disponibles a través de Addgene.

Estos dos módulos son la parte central del conjunto de herramientas y consisten en un sistema modificado de tres niveles adaptado del conjunto de herramientas MoClo de S. cerevisiae23. Para permitir la intercambiabilidad de piezas entre laboratorios, los sitios de restricción (Tabla complementaria 3) y los salientes (Tabla complementaria 2) se diseñaron para que fueran compatibles con los kits de herramientas anteriores de Y. lipolytica GG (Figuras complementarias 2 a 6) 36,37,42. El conjunto básico de plásmidos Lvl0 contiene 40 partes diferentes, incluidos promotores, genes, terminadores, marcadores seleccionables, HA y cadenas principales de vectores con indicadores fluorescentes de E. coli.

El módulo Exp es el único módulo que puede incluir múltiples pasos de ensamblaje (Figuras complementarias 8, 10 a 15). Dependiendo de la estrategia empleada, se debe elegir un vector vacío con el marcador preferido, el locus de integración (es decir, HA), el nivel y el subnivel, como se explica a continuación. Cada Lvl1 vacío se puede utilizar para ensamblar una única TU utilizando plásmidos Lvl0 con el promotor, gen y terminador de interés. Cada casete Lvl1 ensamblado se puede utilizar para sobreexpresar un único gen o para ensamblar un plásmido Lvl2 que contenga múltiples TU. El subnivel de los plásmidos Lvl1 (1, 2 y 3) determina la posición de la TU en el ensamblaje Lvl2 posterior. El subnivel del plásmido Lvl2 (2 y 3) indica el número de TU que pueden ensamblarse en él. El conjunto de herramientas proporcionado tiene la capacidad de ensamblar hasta tres TU, pero este número puede aumentarse aún más en el futuro si es necesario36.

Cada plásmido Lvl1 o Lvl2 contiene HA específicos de 500 pb que permiten la integración de los casetes de sobreexpresión en un locus genómico definido. Inicialmente, se seleccionaron 16 regiones intergénicas en Y. lipolytica W29 (Tabla complementaria 5), se caracterizaron funcionalmente (Figura 27 complementaria) y se usaron para el ensamblaje de otros 80 vectores vacíos Lvl1 y Lvl2 de diferentes subniveles. Los loci de cada cromosoma se han numerado y nombrado en consecuencia como IntA1, IntA2, etc. Se ha suministrado un conjunto adicional de vectores con secuencias Zeta que se pueden utilizar para la integración aleatoria43. Para mantener una nomenclatura estándar, diseñamos un sistema de nombres que abrevia toda la información requerida para cada vector (Figuras complementarias 7, 9). Por ejemplo, pE8US1.1 es un vector Lvl1.1 vacío con HA para la integración en el locus 8 del cromosoma E, que contiene un marcador de resistencia a URA3 y espectinomicina.

El Módulo Pro está formado por el único vector vacío pProUA-mScarlet. Este vector contiene el gen hrGFP bajo la regulación del promotor insertado (Figuras complementarias 24 y 25), lo que permite ensayos de actividad basados en fluorescencia. En consecuencia, cualquier promotor colocado en este vector queda inmediatamente disponible tanto para el ensamblaje de TU como para la integración en Y. lipolytica para la caracterización funcional (Fig. 1). Usando el promotor de ALK1 en Y. lipolytica como ejemplo, la eficiencia de ensamblaje observada del plásmido pProUA-ALK1 fue del 100% (18/18) (Figura complementaria 29 y Tabla complementaria 17).

El módulo Del se basa en un único vector diseñado para el ensamblaje en un solo recipiente de plásmidos de la serie pDel que permiten alteraciones genéticas. El vector vacío pDelUK-RG contiene el casete URA3 flanqueado por los genes RFP (mScarlet) y sfGFP diseñados para la expresión bacteriana. Durante el ensamblaje de GG, ambos informadores son sustituidos por HA amplificadas por PCR que flanquean el gen que debe eliminarse (Figuras complementarias 16 y 18). Los clones correctos se pueden detectar visualmente por la ausencia de ambos fluoróforos (Figura complementaria 17). Como ejemplo, se ensambló el vector pDelUK-AAT1 para la alteración del gen AAT1. Entre las colonias negativas para GFP/RFP, el 50 % (9/18) mostró la estructura correcta mediante análisis de restricción (Figura complementaria 30).

El conjunto de herramientas fue diseñado para permitir el cambio entre diferentes HA con TU ya ensambladas. Esta característica se logró mediante la introducción de dos sitios AarI de tipo IIS que separan la columna vertebral del vector con HA de la sección central que alberga TU. Esto permite el intercambio reversible de partes de GG entre vectores de sobreexpresión vacíos y ensamblados, que pueden seleccionarse mediante resistencia a los antibióticos alterada y abandono de sfGFP (Figura complementaria 19). Para demostrar la eficiencia del intercambio de HA, transferimos tres TU de pZUA2.3-HPD1-ARO4-ARO7 (con flancos de integración Zeta) al vector vacío pE8US1.1 para su integración en el locus IntE8. El 100% (8/8) de los transformantes seleccionados por resistencia a espectinomicina y fenotipo negativo para GFP comprendían el plásmido pE8US-HPD1-ARO4-ARO7 (Figura complementaria 31).

Para que los HA del módulo Del estén disponibles para la integración de construcciones de sobreexpresión, el marcador URA3 en la serie pDel estaba flanqueado por dos sitios AarI, que permiten la eliminación de este marcador. La realización de una reacción GG permite la transferencia irreversible de TU de los vectores Lvl1 y Lvl2 a la serie pDel ensamblada que contiene HA de un gen objetivo (Figura complementaria 20). Utilizando las construcciones pE8US-HPD1-ARO4-ARO7 y pDelUK-AAT1, ensamblamos el plásmido pDelUK-AAT1::HPD1-ARO4-ARO7 con una eficiencia del 58,3% (7/12) (Figura complementaria 32).

El módulo MEx permite cambiar rápidamente de una integración sin marcadores a una integración basada en marcadores sin pasos GG adicionales. Esto se logra mediante la transformación de cualquier mezcla de reacción GG requerida (es decir, de los módulos Exp, Del o Int) en dos cepas diferentes de E. coli. Una de estas cepas es un huésped de transformación regular (por ejemplo, DH5alfa), mientras que la otra es la cepa EcoCre, diseñada para sobreexpresar la recombinasa Cre (Sección 1.6 del Material complementario). Dado que la secuencia del marcador está flanqueada por los sitios Lox66 y Lox7144, esta parte se elimina instantáneamente en las células EcoCre (Figura complementaria 21). El ensamblaje de ambas versiones de plásmidos en paralelo nos permite revertir inmediatamente a un enfoque basado en marcadores en los casos en que la integración sin marcadores no es eficiente. La escisión de URA3 utilizando la cepa EcoCre con los plásmidos pC2US1.1-hrGFP, pD12US1.1-hrGFP y pE8US1.1-hrGFP mostró una eficiencia del 100% (24/24) (Figura complementaria 33).

El Cas9-helper es un vector episomal que proporciona resistencia a la nourseotricina (Nat) y expresa tanto Cas9 como la guía (gRNA). Este módulo permite el ensamblaje de un nuevo ARNg utilizando un único oligonucleótido de 90 bases que codifica las 20 bases necesarias para el reconocimiento de la secuencia (Figuras complementarias 22 y 23). Este oligonucleótido se cotransforma con el auxiliar vacío pCasNA-RK en la cepa recombinante de E. coli EcoRed. Dado que pCasNA-RK contiene un casete contraseleccionable (rpsL-kanR), los recombinantes deseados se pueden aislar mediante resistencia a la estreptomicina. La eficiencia del ensamblaje de los ayudantes de Cas9 se probó utilizando tres secuencias de reconocimiento de 20 bases generadas aleatoriamente, que dieron como resultado los plásmidos pCasNA-Rdm1, pCasNA-Rdm2 y pCasNA-Rdm3 (Tabla complementaria 17). El porcentaje de clones correctos fue del 79,4% (27/34) (Figura complementaria 34). El kit de herramientas contiene un conjunto de ayudantes de Cas9 preensamblados para la integración sin marcadores en 16 loci estándar (Tabla complementaria 8).

La eficacia de los knockouts sin marcadores se evaluó utilizando los genes ARO8 y ARO9. Se cotransformó una cepa mutante Ku70 de Y. lipolytica con diferentes combinaciones de casete de alteración genética libre de marcadores y auxiliar Cas9. Se probaron tres secuencias de ARNg alternativas para cada gen. Las eficiencias de interrupción en experimentos separados variaron entre 50% y 100%, mientras que el promedio de los tres fue 77,8% (28/36) (Figura complementaria 35).

Para comprobar la eficacia de la integración sin marcadores de construcciones de sobreexpresión, se seleccionaron los loci IntC2, IntD12 e IntE8. En consecuencia, tres plásmidos Lvl1 libres de marcadores que albergan el gen hrGFP bajo el promotor TEF1 se cotransformaron con los correspondientes ayudantes de Cas9 en la cepa prototrófica de Y. lipolytica mutante Ku70. Varias colonias de rápido crecimiento, seleccionadas por resistencia a Nat, de cada experimento de transformación se verificaron mediante PCR de colonias y se analizaron para detectar fluorescencia verde. La eficiencia de la integración sin marcadores varió entre 44,4% y 88,9%, con un promedio de 64% (32/50) (Figura complementaria 36).

Para probar el sistema de detección, se generaron varias bibliotecas de promotores. Como fuente de promotores, elegimos genes ribosómicos de Y. lipolytica que codifican proteínas de subunidades grandes (38 genes) y pequeñas (26 genes), así como otros 29 genes que se espera que estén altamente expresados (Sección 8.1 de Material complementario). Además, se diseñó una biblioteca de 43 promotores híbridos que combinan las regiones aguas arriba de genes de varias especies de levadura diferentes, incluidas Candida hispaniensis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Komagataella phaffii, Ogataea polymorpha, S. cerevisiae e Y. lipolytica (Sección 8.2 de Material suplementario). Todos los promotores probados se ensamblaron como plásmidos de la serie pPro y se integraron en el locus IntC2 de la cepa mutante Ura-Ku70 utilizando Cas9-helper y Nat-selection. Los transformantes se verificaron primero mediante prototrofia de uracilo y luego se confirmaron mediante PCR. Los promotores fuertes se seleccionaron visualmente mediante fluorescencia de biomasa (Fig. 2, Figs. complementarias 28 y 43). La fuerza relativa de cada promotor se midió utilizando un lector de placas o una citometría de flujo durante la fase de crecimiento exponencial en dos medios diferentes (Fig. 2, Tablas complementarias 12-15). Identificamos una variedad de promotores con diferente fuerza que amplía significativamente el número de promotores caracterizados para Y. lipolytica. Curiosamente, identificamos 7 promotores más fuertes que TEF1, 5 híbridos y 2 promotores ribosómicos.

En el módulo Pro, se puede ensamblar fácilmente un promotor amplificado en un solo paso GG mediante la selección de exclusión RFP. Los plásmidos de la serie pPro resultantes se pueden utilizar tanto para el ensamblaje TU en el módulo Exp como para el ensayo del promotor después de la integración en el genoma de la levadura. La integración de una sola copia en el locus estándar se ve facilitada por un plásmido auxiliar Cas9 cotransformado. Los transformantes se seleccionan primero mediante la resistencia Nat codificada por el ayudante episomal, seguido de la verificación del fenotipo Ura+ que confirma la integración de la construcción. La placa de 96 pocillos que se muestra en la imagen demuestra la fluorescencia de la biblioteca transformante de Y. lipolytica con 93 promotores nativos cultivados en medio YPD (Sección 8.1 del Material complementario). Dos paneles inferiores contienen gráficos de barras con 93 promotores nativos y 43 híbridos que se analizaron utilizando un lector de placas y un citómetro de flujo respectivamente. Los datos se blanquearon utilizando la cepa original S234 (0%) y se normalizaron mediante la actividad del promotor TEF1 (100%). Para cada promotor, la fluorescencia de GFP se analizó en medios mínimos (azul) y ricos (rojo) con 2% de glucosa (YNBD, YPD) o 2% de glicerol (YNBG e YPG) como fuente de carbono. Se muestran dos réplicas biológicas que utilizan transformantes independientes con la misma construcción. Los datos de origen se proporcionan como Datos complementarios 1.

Para demostrar la utilidad de nuestra metodología CRISPR/Cas9 mejorada, decidimos crear una Y. lipolytica productora de HGA mediante ingeniería racional. En condiciones alcalinas, el HGA se oxida espontáneamente y se autopolimeriza para formar piomelanina, que es un excelente componente de los protectores solares y cosméticos naturales45. Además, el HGA es el precursor bioquímico de dos familias diferentes de moléculas de alto valor, los plastoquinoles y los tocoferoles46. A pesar de su alto potencial comercial, las tecnologías disponibles para la producción de HGA y piomelanina se basan en la biotransformación de costosos aminoácidos aromáticos47. Los aromáticos se biosintetizan a través de la vía del shikimato y parten de dos intermediarios del metabolismo central, el fosfoenolpiruvato y la eritrosa-4-fosfato. La tirosina comparte con HGA el intermedio común 4-hidroxifenilpiruvato, un precursor directo de ambas moléculas (Fig. 3a).

a Representación esquemática de la vía de producción de HGA diseñada en Y. lipolytica. Flechas verdes, pasos sobreexpresados. Flechas rojas, reacciones inactivadas. Flechas moradas, reacciones enzimáticas que se cree que están codificadas por otros dos ORF en el grupo de degradación de HGA de Y. lipolytica. Los genes que codifican los pasos enzimáticos correspondientes se muestran junto a las reacciones. Los metabolitos se acortan de la siguiente manera: fosfoenolpiruvato de PEP, eritrosa-4-fosfato E4P, 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato 7-fosfato de DAHP, 3-deshidroquinato de DHQ, 3-deshidro-shikimato de DHS, shikimato de SHIK, shikimato-3-SHP fosfato, EP3P 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato, corismato CHA, prefenato de PPA, para-hidroxi-fenilpiruvato de HPP, fenilpiruvato de PPY, 4-maleil-acetoacetato de MAA, 4-fumaril-acetoacetato de FAA, fumarato de FUM, acetoacetato de AAС, Tyr L-tirosina, Phe L-fenilalanina. b Resumen de modificaciones introducidas en cepas productoras de HGA. Los símbolos delta y flecha hacia arriba se utilizan para indicar la eliminación y sobreexpresión respectivamente de los genes correspondientes. c Acumulación de HGA mediante cepas modificadas genéticamente después de 14 días de cultivo en medio YNB con 9% de glucosa. Se muestran dos réplicas biológicas. Los datos de origen se proporcionan como Datos complementarios 1. d Acumulación visible de piomelanina por cepas modificadas genéticamente en el caldo de cultivo después de un cultivo de 7 días en el medio YNB con citrato al 2%.

Primero, seleccionamos varios genes que codifican supuestas aminotransferasas aromáticas como objetivos para la ingeniería. Esta actividad elimina el flujo de carbono del HGA y conduce a la acumulación de tirosina y fenilalanina. Además, estos dos aminoácidos participan en la inhibición por retroalimentación de varios pasos de la vía del shikimato48, 49. La mayoría de los organismos poseen dos tipos de aminotransferasas aromáticas que muestran similitud con la proteína Aro8 de S. cerevisiae o TyrB de E. coli, que está estrechamente relacionado con Aat1 de Aspergillus sp50,51. En Y. lipolytica, observamos dos parálogos de cada tipo, denominados ARO8, ARO9 y AAT1, AAT2, respectivamente. Utilizando un enfoque de integración sin marcadores, interrumpimos tres (ARO8, ARO9 y AAT2) de cuatro supuestos genes de aminotransferasas en una cepa mutante Ku70 y aislada con todas las combinaciones posibles de estas tres eliminaciones (Figura complementaria 37). Sin embargo, la alteración sin marcadores del cuarto gen de la aminotransferasa (AAT1) en el triple mutante no tuvo éxito a pesar de numerosos intentos. Cabe destacar que la misma eliminación del gen AAT1 funcionó bien en una cepa parental. Este resultado sugirió que la inactivación del cuarto gen afectó negativamente a la viabilidad de Y. lipolytica. Para aumentar la presión de selección, cambiamos a una construcción basada en marcadores que contiene el gen URA3. De acuerdo con nuestras suposiciones, la aplicación del marcador auxotrófico nos permitió aislar una cepa con las cuatro alteraciones genéticas, así como otras cepas con combinaciones de estas cuatro deleciones. El fenotipo de crecimiento lento siempre se observó en experimentos de transformación que combinaban deleciones de los genes AAT1 y AAT2 (Figuras complementarias 38 y 39). Por lo tanto, estos resultados sugieren una interacción epistática, también conocida como mejora sintética18, entre estos dos genes.

A continuación, seleccionamos tres objetivos de sobreexpresión con el potencial de mejorar la síntesis de novo de HGA; ARO4, ARO7 y HPD1. Elegimos los genes mutados de S. cerevisiae ARO4K229L y ARO7G141S que codifican enzimas resistentes a la retroalimentación que se sabe que mejoran los flujos metabólicos a través de la vía del shikimato52,53. El tercer gen, HPD1, codifica una 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa de Y. lipolytica54. Los tres genes se ensamblaron con el fuerte promotor TEF1 en los vectores Lvl1 y se combinaron en un casete Lvl2. Los intentos de integrar las tres TU usando un enfoque sin marcadores no dieron como resultado el aislamiento de los transformantes deseados independientemente de la cepa receptora utilizada, por ejemplo, con o sin deleciones del gen aminotransferasa. La transformación con los tres genes por separado utilizando un enfoque sin marcadores nos permitió sobreexpresar los genes ARO7G141S y HPD1, mientras que no se aislaron colonias con ARO4K229L (Sección 7.1 del Material complementario). Al mismo tiempo, un experimento de control que utilizó una construcción basada en marcadores permitió la sobreexpresión de ARO4K229L; sin embargo, los clones correctos siempre tuvieron un tamaño más pequeño en comparación con los transformantes incorrectos (Figura complementaria 40). Debido a los defectos de crecimiento tanto de la sobreexpresión de ARO4K229L como de la doble eliminación de ∆aat1∆aat2, decidimos ensamblar estas dos modificaciones utilizando CRISPR/Cas9 combinado y selección basada en marcadores. Tanto las cepas mutantes triples (∆aro8∆aro9∆aat2) como cuádruples (∆aro8∆aro9∆aat2∆aat1) se cotransformaron con la construcción basada en marcadores (pE8US-HPD1-ARO4-ARO7) y el correspondiente Cas9-helper ( pCasNA-IntE8). Primero seleccionamos el plásmido auxiliar en el medio líquido con Nat y luego la construcción integradora en el medio sólido sin uracilo. Este método permitió el aislamiento de derivados mutantes de aminotransferasa triple y cuádruple con la sobreexpresión de tres genes requeridos, denominados S946 y S948, respectivamente.

Finalmente, decidimos investigar e inactivar la vía de degradación de HGA. Sin embargo, esta vía aún se desconocía en Y. lipolytica. En la mayoría de los organismos, incluidos los hongos, la vía de degradación del HGA comienza con la actividad de la homogentisato 1,2-dioxigenasa55. El análisis detallado del genoma de Y. lipolytica W29 y la resecuenciación de la región seleccionada nos permitieron identificar un ORF omitido durante el análisis anterior del genoma completo. Designamos este ORF como HMG2 y codifica una proteína que es muy similar al homogentisato 1,2-dioxigenasa de otras especies (número de acceso de GenBank MZ387986). Este gen es la última secuencia única del cromosoma D seguida de elementos repetitivos. Curiosamente, junto a este gen, también identificamos dos genes que codifican la supuesta fumarilacetoacetato hidrolasa y la glutatión S-transferasa, que, junto con HMG2, se sugiere que están involucrados en la degradación de HGA en otros hongos56. Además, está bien documentado que Y. lipolytica produce frecuentemente mutantes que secretan un pigmento marrón57,58, que podría ser piomelanina formada a partir de componentes de medios ricos. Debido a la posición del gen HMG2, anticipamos que dichos mutantes podrían estar asociados con el truncamiento espontáneo de esta región telomérica. Por lo tanto, decidimos inducir dicho truncamiento artificialmente utilizando un auxiliar Cas9 que corta el interior del gen HMG2. De hecho, la transformación de una cepa con antecedentes de tipo salvaje indujo la formación intensiva de pigmento marrón en medios ricos (Figura complementaria 42). Después de esto, indujimos truncamientos similares en las cepas S946 y S948, lo que llevó a la creación de S997 y S987 respectivamente (Fig. 3b). Descubrimos que ambas cepas pudieron sintetizar HGA y piomelanina de novo, en medios con 9% de glucosa y 2% de citrato como fuentes únicas de carbono, respectivamente (Fig. 3c, d). Después de 14 días de incubación en medio mínimo con 9% de glucosa, la cepa S997, un derivado del mutante triple aminotransferasa, fue la mejor productora con 373,8 mg/L de HGA, mientras que S987 produjo 339,1 mg/L de HGA (Tabla complementaria 11). ).

Los avances futuros en la ingeniería metabólica de organismos vivos dependerán, en gran medida, de la disponibilidad de tecnologías de manipulación del ADN rápidas y eficientes. Gracias a los sistemas GG jerárquicos y modulares, el ensamblaje rápido de múltiples TU ya no es un factor limitante importante. Sin embargo, los conjuntos de herramientas de ingeniería actuales aún muestran margen de mejora para volverse más versátiles y generalizados, por ejemplo, facilitando aún más la integración genómica iterativa de la sobreexpresión. y construcciones de eliminación.

Para fines de ingeniería metabólica de levaduras, la aplicación de CRISPR/Cas9 facilita las integraciones consecutivas de ADN gracias a sus capacidades sin marcadores. En comparación con un sistema que utiliza un marcador integrativo único, esta tecnología acelera la construcción de la tensión en más de dos veces (Fig. 4 y Fig. 26 complementaria). Sin embargo, la construcción de modificaciones industrialmente relevantes, en muchos casos, todavía requiere la solidez de la selección basada en marcadores. Sorprendentemente, incluso en nuestro proceso demostrativo de ingeniería metabólica encontramos efectos tóxicos tanto de la sobreexpresión (ARO4K229L) como de la alteración genética (combinación de ∆aat1 y ∆aat2), que solo pudimos diseñar utilizando construcciones basadas en marcadores. Estos casos demuestran que la capacidad de volver a un enfoque basado en marcadores es ventajosa para diseñar rápidamente vías complejas. Aquí, proporcionamos una solución (Módulo MEx) que permite utilizar el mismo ensamblaje de ADN para producir construcciones basadas y sin marcadores. Por lo tanto, siempre que se requiera una construcción de base de marcador, este módulo puede ahorrar varios días de trabajo al evitar la necesidad de un reensamblaje de novo.

El conjunto de herramientas permite cambiar frecuentemente entre integración basada en marcadores y sin marcadores combinando las ventajas de ambas tecnologías. Una integración más sólida basada en marcadores requiere al menos 11 días, ya que incluye el procedimiento de recuperación de marcadores. La aplicación de la integración sin marcadores con CRISPR/Cas9 permite una única ronda de integración en 5 días (imagen, arriba). Cualquier reacción de ensamblaje de GG única podría usarse para la producción de vectores con y sin marcador. Al mismo tiempo, utilizando el sistema de intercambio HA, cualquier casete de integración ensamblado para sobreexpresión, independientemente de su complejidad, puede redirigirse a loci alternativos del genoma en 2 días. Además, tanto el ARNg como el donante pueden redirigirse a loci alternativos en tan solo 2 días (imagen, abajo a la izquierda).

Además, la ingeniería metabólica que utiliza CRISPR/Cas9 requiere una redirección frecuente del ADN del donante y de las construcciones de ARNg hacia loci genómicos alternativos. Si bien esto se puede lograr utilizando técnicas de clonación estándar que requieren amplificación y/o purificación en gel de fragmentos de ADN, no hemos podido encontrar en la literatura un ejemplo en el que ambos HA puedan reemplazarse en un solo paso de ensamblaje. Aquí, demostramos un sistema de intercambio de HA en un solo recipiente, que comprende una única reacción GG entre dos plásmidos no digeridos (Módulo Int). Esto permite la redirección de donantes complejos a cualquier loci de integración disponible, incluidos los objetivos de eliminación, en solo dos días (Sección 1.5 del Material complementario).

Además, aunque ahora hay muchas técnicas disponibles para la recodificación de ARNg en plásmidos auxiliares Cas9, varían mucho en el número y la complejidad de las manipulaciones moleculares. Decidimos evitar pasos complejos in vitro mediante el uso de recombinación directa de un único oligonucleótido en el ayudante vacío dentro del huésped de ensamblaje bacteriano diseñado (módulo Cas). Esto acorta el tiempo necesario para el ensamblaje al tiempo requerido para la transformación bacteriana, que sería más rápida que cualquier técnica basada en clonación (Tabla complementaria 4).

Otro componente fundamental de los proyectos de ingeniería metabólica es lograr un control estricto de la expresión genética. Esto requiere la disponibilidad de un amplio espectro de promotores bien caracterizados para organismos huéspedes individuales. Utilizando las propiedades únicas de CRISPR/Cas9 para garantizar la integración precisa de copias individuales, organizamos un sistema de detección de promotores eficiente (Módulo Pro). Un simple paso de clonación hace que los promotores estén disponibles de inmediato tanto para el ensamblaje de TU como para las pruebas in vivo en levadura.

En combinación, las metodologías descritas anteriormente nos permiten mejorar las tecnologías CRISPR/Cas9 actuales y mejorar su potencial para la ingeniería metabólica de levaduras. Utilizando el caballo de batalla industrial Y. lipolytica, construimos un conjunto de herramientas inicial con una arquitectura nueva y versátil. Todos los procedimientos fueron diseñados para maximizar la velocidad y minimizar la complejidad. Se estimó que la eficiencia de todos los pasos diseñados fue de al menos el 50 %, lo que hace que el conjunto de herramientas sea eficaz.

Para evaluar la eficiencia de nuestro sistema de detección de promotores, estudiamos comparativamente la expresión de 137 promotores durante el crecimiento en dos medios diferentes. Entre los 43 promotores híbridos analizados, observamos cinco que generaban una mayor fluorescencia que el promotor TEF1 ampliamente utilizado. Todos ellos contenían la región proximal de Y. lipolytica TEF1p y mostraban una mayor resistencia que la versión no truncada. Esto puede haber sido el resultado de la eliminación de un sitio de unión del regulador de la transcripción específico que reprime la expresión de TEF1. Si estuviera presente, este sitio estaría en la región distal que fue sustituida en estos cinco fuertes promotores híbridos. Entre los 94 promotores naturales probados, dos (RPL25 y TDH1) también demostraron niveles de expresión más altos que el promotor de tipo salvaje más fuerte conocido anteriormente, TEFin, una variación del promotor TEF1 con el intrón natural59. Estos nuevos promotores fuertes serán de gran interés para la ingeniería de Y. lipolytica. El resto de la biblioteca mostró una gran variedad de niveles de expresión (entre 0,1% y 104% de TEF1p), lo que puede ser útil para ajustar las vías metabólicas. Esta es la biblioteca más grande jamás probada en este organismo, lo que amplía significativamente el número total de promotores caracterizados disponibles en Y. lipolytica60,61,62.

Como prueba de concepto de las aplicaciones del conjunto de herramientas en ingeniería metabólica, construimos una cepa de Y. lipolytica que produce 373,8 mg/L de HGA en medios mínimos. Para este propósito, combinamos objetivos previamente conocidos y varios objetivos recientemente caracterizados para la sobreexpresión y eliminación. Curiosamente, descubrimos una vía de degradación de HGA "oculta", que está ausente en dos de las cinco cepas de Y. lipolytica secuenciadas, WSH-Z06 y CLIB122. Aunque el grupo de genes colineales se presenta en hongos miceliales evolutivamente distantes, no podemos asumir la transferencia horizontal de genes debido a la baja similitud de secuencia (Figura complementaria 41). Por el contrario, la ubicación cerca del final del cromosoma sugirió su pérdida filogenética espontánea como el evento más probable. El truncamiento inducido de este telómero nos permitió obtener mutantes sobreacumuladores de piomelanina con un fenotipo marrón característico. Los mutantes espontáneos con este fenotipo son frecuentes en Y. lipolytica y conducen a problemas bien conocidos en la elaboración del queso63. El descubrimiento de este grupo de genes y su ubicación arroja luz sobre los antecedentes genéticos de este fenómeno. Mientras se preparaba este manuscrito, se publicó un estudio que describe la sobreexpresión de ocho genes diferentes en Y. lipolytica, lo que resultó en el primer ejemplo de biosíntesis de novo de HGA con un título final de 650 mg/L54. Sin embargo, en ese trabajo, el mayor aumento en la producción se logró en el paso final de ingeniería mediante el aislamiento de un clon único que producía 15 veces más HGA que otros transformantes con la misma construcción. En particular, este clon se seleccionó en función de su intensa pigmentación marrón, que suponemos que puede ser el resultado de un truncamiento espontáneo de telómeros similar al descrito aquí.

En resumen, nuestro trabajo presenta un ejemplo de conjunto de herramientas moleculares mejorado diseñado para ingeniería metabólica basada en CRISPR/Cas9. Hemos demostrado su utilidad tanto para la construcción rápida de cepas como para la caracterización de una gran biblioteca de promotores. Anticipamos que este conjunto de herramientas puede permitir aplicaciones más amplias de esta tecnología de vanguardia en ingeniería de tensiones con fines industriales. Al mismo tiempo, la estructura versátil del kit de herramientas permite ampliar sus capacidades, por ejemplo, aumentar el número de loci de integración, ensamblar más TU o incluir nuevos módulos como los de edición base CRISPR/Cas9, activación CRISPR o inhibición CRISPR. , o multiplexación CRISPR. Además, las soluciones metodológicas probadas aquí en el modelo de Y. lipolytica pueden aplicarse a otros organismos, así como a otros campos de la ingeniería biológica.

Para el cultivo de Escherichia coli se utilizó el medio Luria Bertani (VWR). El medio de crecimiento mínimo de levadura fue YNB (6,7 g/l de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, Sigma-Aldrich) suplementado con glucosa (VWR, 101174Y) (YNBD), glicerol (VWR, 24388.320) (YNBG) o sodio. citrato (VWR, 27833.237) en diversas concentraciones según se especifica en el texto. Cuando fue necesario, YNB se complementó con casaminoácidos (Thermofisher, #223050), uridina (Sigma-Aldrich, U3750), aminoácidos [L-leucina (Sigma-Aldrich, L8000), L-histidina (Sigma-Aldrich, H8000), L-tirosina (Sigma-Aldrich, T3754), L-triptófano (Sigma-Aldrich, T0254), L-fenilalanina (Formedium, DOC0172), L-aspartato (Sigma-Aldrich, 11195)] y tampón fosfato [hidrogenofosfato de sodio , Na2HPO4 (Alfa Aesar, 13437) y dihidrógenofosfato de sodio, NaH2PO4-2H2O(VWR, 28015.261)] según se especifica. El medio de crecimiento rico en levadura fue YPD (10 g/L de extracto de levadura (Sigma-Aldrich, Y1625), 20 g/L de peptona (Merck, 1.11931) y 20 g/L de glucosa) o YPG (10 g/L de extracto de levadura, 20 g/l de peptona y 2 % vol de glicerol). Las recetas de los medios de crecimiento también se proporcionan en la Nota complementaria 4. Concentraciones de antibióticos, incluida ampicilina (Sigma-Aldrich, A8351), kanamicina (Sigma-Aldrich, K1377), cloranfenicol (Acros Organics, 22792026), estreptomicina (Sigma-Aldrich, S9137 ), espectinomicina (Sigma-Aldrich, S4014), nourseotricina (Fisher Scientific, AB-101-10ML) e higromicina (Life Technologies, 10687010) se resumen en la Tabla complementaria 7. La selección de higromicina se utilizó en el procedimiento de recuperación del fabricante como se describe en la Sección 2.5 del material complementario y la Tabla complementaria 6. Se prepararon medios sólidos añadiendo 20 g/l de agar (Merck, 05039-500 G). Se utilizaron E. coli XL1-Blue (Stratagene) y Turbo (NEB) para el ensamblaje y la propagación del plásmido. Las cepas de Yarrowia lipolytica utilizadas en este estudio se derivan del auxótrofo de uracilo (∆ura3) y del mutante Ku70 (∆ura3∆ku70) aislado de W29 (MatA, tipo salvaje; CLIB89) como se describió anteriormente64. Los genotipos de las cepas que forman parte del conjunto de herramientas se resumen en la Tabla complementaria 9. Estas cepas están disponibles previa solicitud en la Colección Estatal Rusa de Microorganismos Industriales, VKPM.

Todos los plásmidos descritos se ensamblaron mediante clonación general65, ensamblaje de Gibson66, ensamblaje de Golden Gate67 o se sintetizaron utilizando servicios comerciales (Twist Bioscience y Integrated DNA Technologies). Los protocolos detallados para el ensamblaje de la construcción de ADN utilizando el kit de herramientas YaliCraft se proporcionan en las Notas complementarias 1 y 3. Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados en este estudio se enumeran en las Tablas complementarias 10 y 16. Las secuencias de plásmidos se proporcionan en formato genbank (conjunto de datos complementarios). 147 componentes de plásmidos del conjunto de herramientas (Tabla complementaria 8) estarán disponibles a través del repositorio de plásmidos sin fines de lucro Addgene (##175597-175743).

Las cepas de E. coli EcoRed y EcoCre eran derivados del lisógeno λcI857 sensible a la temperatura de la cepa de tipo salvaje MG1655. Ambas cepas se construyeron mediante recombinación68,69 y contenían el profago λ modificado para la expresión inducible por temperatura de los genes λ-Red (gam, bet, exo) o el gen cre del fago P1, respectivamente. La cepa EcoRed contenía la región cro-attR eliminada de la secuencia del profago y contenía la mutación rpsL150 (Lys43Arg) para permitir la contraselección con el gen rpsL70 de tipo salvaje. La cepa EcoCre además poseía una deleción N-attL en el profago con el gen cre insertado bajo el control del promotor PL. Las secuencias de los profagos λ modificados correspondientes a ambas cepas se proporcionan como conjunto de datos complementarios.

Tanto el ARNg como Cas9 se expresaron a partir del plásmido auxiliar episomal de la serie pCasNA, que era el vector pCRISPRyl3 modificado. El nuevo vector contiene la misma secuencia replicativa autónoma, el casete de expresión de Cas9 y elementos reguladores para la expresión de sgRNA71. El gen Cas9 con codones optimizados de Streptococcus pyogenes contenía una señal de localización nuclear SV40 C-terminal y se expresaba a partir del fuerte promotor UAS1B8-TEF (136 pb)71. El casete de expresión de sgRNA se compone de cuatro elementos: el promotor híbrido de ARN polimerasa III SCR1'-tRNAGly, la secuencia de crRNA (objetivo específico de 20 pb), seguido de la secuencia de tracrRNA fusionada a la secuencia terminadora de poli-T polimerasa III. El LEU2 fue reemplazado por un marcador seleccionable de resistencia a nourseotricina. Para aumentar la eficiencia del reconocimiento, eliminamos la base 9 de la secuencia conectora del extremo 5' del sgRNA72. El vector pCasNA-RK vacío en lugar del objetivo específico de 20 pb contiene un casete rpsL-kanR contraseleccionable. Para la integración de la construcción de sobreexpresión o eliminación, el donante correspondiente se cotransformó con el asistente Cas9 que reconoce el mismo locus en el genoma de Y. lipolytica (Nota complementaria 2).

La actividad de los promotores en Y. lipolytica se midió mediante la expresión del gen con codones optimizados que codifica la proteína fluorescente verde Renilla humanizada (hrGFP)73. Las células en crecimiento exponencial se analizaron mediante citometría de flujo utilizando Attune NxT (Thermo Fisher Scientific). Los datos de fluorescencia se recogieron de 10.000 células y se analizaron utilizando el software FlowJo (Ashland, OR). Alternativamente, la fluorescencia se midió utilizando un luminómetro CLARIOstar Plus (BMG Labtech). Se utilizaron dos métodos diferentes debido a la disponibilidad de equipos en las diferentes instituciones. Asimismo, se utilizaron dos medios diferentes (glicerol y glucosa) dependiendo del agente crioprotector utilizado en cada colección (glicerol o DMSO), para evitar una represión catabólica no deseada. Experimentos de caracterización adicionales podrían probar todos los promotores en los diferentes medios y en diferentes momentos. La actividad de los promotores se blanqueó utilizando autofluorescencia de la cepa original sin GFP y se normalizó con respecto a la actividad del promotor TEF1. Los procedimientos detallados de ensayo del promotor mediante citometría de flujo y lector de placas se describen en las Secciones 2.6, 8.1 y 8.2 del Material complementario.

Los genes que codifican las supuestas aminotransferasas aromáticas se identificaron mediante una búsqueda tBLASTn en línea (//blast.ncbi.nlm.nih.gov). Como resultado, se asignaron cuatro genes, incluidos ARO8 (YALI1_E24922g), ARO9 (YALI1_C06681g), AAT1 (YALI1_B03198g) y AAT2 (YALI1_F36966g). El ORF correspondiente a HPD1 (YALI1_B28454g) coincidió con una secuencia publicada recientemente54. No se había asignado ninguna etiqueta de locus para el gen HMG2 durante las anotaciones del genoma debido a mutaciones aparentes de cambio de marco (CP017556.1 y CP028451.1). La secuencia revisada del gen HMG2 de Y. lipolytica W29 está disponible en GenBank con el número de acceso MZ387986.

La concentración de ácido homogentísico (HGA) se estimó en el sobrenadante después de la separación de la biomasa mediante UPLC/MS, utilizando un cromatógrafo de afinidad Agilent 1290 conectado a un espectrómetro de masas Agilent 6550 Q-ToF. La separación se logró utilizando una columna Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (2,1 × 50 mm, 1,8 µm) y un gradiente de acetonitrilo del 0 % durante 2 minutos y luego un aumento al 98 % durante 0,5 minutos a un caudal de 0,3 ml/min. Los datos espectrales de masas se adquirieron en modo de iones negativos desde m/z 90 a 1000 a una velocidad de 3 espectros por segundo durante toda la separación. Se inyectaron 0,2 µL de ambos pocillos de muestra y soluciones estándar preparadas a partir de HGA disponible comercialmente (H0751, Sigma-Aldrich).

Los experimentos se realizaron por duplicado o réplica según se explica en cada caso particular. El promedio se muestra en un gráfico de barras, así como en puntos de datos individuales.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen se proporcionan como Datos complementarios 1. Las secuencias de plásmidos se proporcionan en formato genbank como conjunto de datos complementarios. Los componentes del kit de herramientas estarán disponibles a través del depósito de plásmidos sin fines de lucro Addgene (##175597-175743). Cualquier información restante se puede obtener del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Nielsen, J., Larsson, C., van Maris, A. y Pronk, J. Ingeniería metabólica de levaduras para la producción de combustibles y productos químicos. actual. Opinión. Biotecnología. 24, 398–404 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

DiCarlo, JE et al. Ingeniería del genoma en Saccharomyces cerevisiae mediante sistemas CRISPR-Cas. Ácidos nucleicos res. 41, 4336–4343 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schwartz, CM, Hussain, MS, Blenner, M. & Wheeldon, I. Los promotores sintéticos de la ARN polimerasa III facilitan la edición del genoma mediada por CRISPR-Cas9 de alta eficiencia en Yarrowia lipolytica. Sintetizador ACS. Biol. 5, 356–359 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Raschmanová, H., Weninger, A., Glieder, A., Kovar, K. & Vogl, T. Implementación de tecnologías CRISPR-Cas en levaduras convencionales y no convencionales: estado actual y perspectivas futuras. Biotecnología. Adv. 36, 641–665 (2018).

Artículo PubMed Google Scholar

Tsai, CS y cols. Refactorización rápida y sin marcadores de cepas de levadura fermentadora de xilosa con Cas9/CRISPR. Biotecnología. Bioeng. 112, 2406–2411 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Jessop-Fabre, MM et al. EasyClone-MarkerFree: un conjunto de herramientas vectoriales para la integración de genes sin marcadores en Saccharomyces cerevisiae mediante CRISPR-Cas9. Biotecnología. J. 11, 1110-1117 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, L. y col. Edición eficiente del genoma múltiplex mediada por CRISPR-Cas9 en levaduras. Biotecnología. Biocombustibles 11, 277 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, Q. y col. Integración de multiloci genómicos mediada por CRISPR-Cas9 en Pichia pastoris. Micro. Hecho celular. 18, 44 (2019).

Artículo de Google Scholar

Holkenbrink, C. y col. EasyCloneYALI: caja de herramientas sintética basada en CRISPR/Cas9 para la ingeniería de la levadura Yarrowia lipolytica. Biotecnología. J. 13, e1700543 (2018).

Artículo PubMed Google Scholar

Laughery, MF et al. Nuevos vectores para la edición del genoma CRISPR-Cas9 simple y optimizada en Saccharomyces cerevisiae. Levadura 32, 711–720 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Cai, P., Gao, J. & Zhou, Y. Edición del genoma mediada por CRISPR en levaduras no convencionales para aplicaciones biotecnológicas. Micro. Hecho celular. 18, 63 (2019).

Artículo de Google Scholar

Kretzschmar, A. y col. Aumento de la frecuencia de integración homóloga en cepas de Yarrowia lipolytica defectuosas en la unión de extremos no homólogos. actual. Genet 59, 63–72 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Babaei, M. y col. Ingeniería de levadura oleaginosa como huésped para la producción fermentativa de ácido succínico a partir de glucosa. Bioeng frontal. Biotecnología. 27, 361 (2019).

Artículo de Google Scholar

Gao, C. y col. Producción robusta de ácido succínico a partir de glicerol crudo utilizando Yarrowia lipolytica diseñada. Biotecnología. Biocombustibles 9, 179 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Milne, N. y col. Ingeniería metabólica de Saccharomyces cerevisiae para la producción de novo de psilocibina y derivados de triptamina relacionados. Metab. Ing. 60, 25-36 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Makanae, K., Kintaka, R., Makino, T., Kitano, H. y Moriya, H. Identificación de genes sensibles a la dosis en Saccharomyces cerevisiae utilizando el método genético de tira y afloja. Genoma Res 23, 300–311 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Giaever, G. et al. Perfil funcional del genoma de Saccharomyces cerevisiae. Naturaleza 418, 387–391 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Adames, NR, Gallegos, JE y Peccoud, J. Pantallas de interacción genética de levaduras en la era de CRISPR/Cas. actual. Genet 65, 307–327 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Babaei, M. y col. Ampliación del kit de herramientas EasyClone-MarkerFree para el genoma de Saccharomyces cerevisiae con nuevos sitios de integración. FEMS Levadura Res. 21, foab027 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, W., Gao, J., Zhai, X. y Zhou, YJ Detección de sitios neutros para la ingeniería metabólica de la levadura metilotrófica Ogataea polymorpha. Sintetizador. Sistema. Biotecnología. 6, 63–68 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, M. y col. La integración multigénica mediada por CRISPR permite la refactorización de la vía Shikimate para mejorar la biosíntesis de 2-feniletanol en Kluyveromyces marxianus. Biotecnología. Biocombustibles 14, 3 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brady, J.R. y col. Identificación de sitios mejorados para la integración de genes heterólogos utilizando ATAC-seq. Sintetizador ACS. Biol. 9, 2515–2524 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, ME, DeLoache, WC, Cervantes, B. y Dueber, JE Un conjunto de herramientas de levadura altamente caracterizado para ensamblaje modular de varias partes. Sintetizador ACS. Biol. 4, 975–986 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nguyen, N., Quail, MMF y Hernday, AD Un sistema eficiente, rápido y reciclable para la edición del genoma mediada por nítido en Candida albicans. mSphere 2, e00149–17 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gowers, G.-OF et al. Biosíntesis mejorada de ácido betulínico mediante recombinación de cromosomas de levadura sintética y detección rápida semiautomática de LC-MS. Nat. Comunitario. 11, 868 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y. et al. Una matriz de ARNg-ARNt para la edición rápida del genoma multiplexado basada en CRISPR-Cas9 en Saccharomyces cerevisiae. Nat. Comunitario. 10, 1053 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, XT y col. tCRISPRi: control de la expresión génica en un solo paso, ajustable y reversible. Ciencia. Rep. 6, 39076 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McCleary, WR Aplicación de técnicas de intercambio de promotores para controlar la expresión de genes cromosómicos. Appl Microbiol Biotechnol. 84, 641–648 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Rajkumar, AS, Varela, JA, Juergens, H., Daran, J.-MG y Morrissey, JP Piezas biológicas para biología sintética de Kluyveromyces marxianus. Bioeng frontal. Biotecnología. 7, 97 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Weninger, A. y col. Ampliar el conjunto de herramientas CRISPR/Cas9 para Pichia pastoris con una integración eficiente de los donantes y marcadores de resistencia alternativos. J. Cell Biochem 119, 3183–3198 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Storici, F., Durham, CL, Gordenin, DA y Resnick, MA Las roturas de doble hebra específicas del sitio cromosómico son el objetivo eficaz para la reparación mediante oligonucleótidos en levadura. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 100, 14994–14999 (2003).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Park, YK y Ledesma-Amaro, R. ¿Qué hace que Yarrowia lipolytica sea adecuada para la industria? Tendencias Biotecnología. 41, 242–254 (2023).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Larroude, M., Trabelsi, H., Nicaud, J.-M. & Rossignol, T. Un conjunto de vectores CRISPR/Cas9 de Yarrowia lipolytica para explotar la diversidad de cepas de tipo salvaje. Biotecnología. Letón. 42, 773–785 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baisya, D., Ramesh, A., Schwartz, C., Lonardi, S. y Wheeldon, I. Las pantallas funcionales de todo el genoma permiten la predicción de guías CRISPR-Cas9 y -Cas12a de alta actividad en Yarrowia lipolytica. Nat. Comunitario. 13, 922 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schwartz, C. & Wheeldon, I. Edición del genoma mediada por CRISPR-Cas9 y control transcripcional en Yarrowia lipolytica. Métodos Mol. Biol. 1772, 327–345 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Celińska, E. et al. Sistema Golden Gate Assembly dedicado a la manipulación de vías complejas en Yarrowia lipolytica. Micro. Biotecnología. 10, 450–455 (2017).

Artículo de Google Scholar

Larroude, M. y col. Un conjunto de herramientas modular Golden Gate para la biología sintética de Yarrowia lipolytica. Micro. Biotecnología. 12, 1249-1259 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Li, YW y cols. YALIcloneNHEJ: un conjunto de herramientas de clonación modular eficiente para la integración NHEJ de la vía multigénica y la producción de terpenoides en Yarrowia lipolytica. Bioeng frontal. Biotecnología. 9, 816980 (2021).

Artículo PubMed Google Scholar

Egermeier, M., Sauer, M. & Marx, H. Estrategia de ingeniería metabólica basada en Golden Gate para cepas naturales de Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiol Lett. 366, fnz022 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bredeweg, EL et al. Una caja de herramientas genética molecular para Yarrowia lipolytica. Biotecnología. Biocombustibles 10, 2 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Wong, L., Engel, J., Jin, E., Holdridge, B. y Xu, P. YaliBricks, un conjunto de herramientas genéticas versátil para la ingeniería de vías rápida y simplificada en Yarrowia lipolytica. Metab. Ing. Comunitario. 5, 68–77 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

He, Q., Szczepańska, P., Yuzbashev, TV, Lazar, Z. & Ledesma-Amaro, R. Producción de novo de resveratrol a partir de glicerol mediante la ingeniería de diferentes vías metabólicas en Yarrowia lipolytica. Metab. Ing. Comunitario. 11, e00146 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Juretzek, T. y col. Vectores para expresión y amplificación de genes en la levadura Yarrowia lipolytica. Levadura 18, 97-113 (2001).

3.0.CO;2-U" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1097-0061%2820010130%2918%3A2%3C97%3A%3AAID-YEA652%3E3.0.CO%3B2-U" aria-label="Article reference 43" data-doi="10.1002/1097-0061(20010130)18:23.0.CO;2-U">Artículo CAS PubMed Google Scholar

Albert, H., Dale, EC, Lee, E. & Ow, DW Integración de ADN específica del sitio en sitios lox mutantes y de tipo salvaje ubicados en el genoma de la planta. Planta J. 7, 649–659 (1995).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Martínez, LM, Martinez, A. & Gosset, G. Producción de melaninas con microorganismos recombinantes. Bioeng frontal. Biotecnología. 7, 285 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Shen, B. y col. Producción fermentativa de tocotrienoles de vitamina E en Saccharomyces cerevisiae bajo control de temperatura provocado por un choque de frío. Nat. Comunitario. 11, 5155 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ben Tahar, I., Kus-Liśkiewicz, M., Lara, Y., Javaux, E. & Fickers, P. Caracterización de un pigmento de piomelanina no tóxico producido por la levadura Yarrowia lipolytica. Biotecnología. Prog. 36, e2912 (2020).

PubMed Google Académico

Luttik, MAH y cols. Alivio de la inhibición de la retroalimentación en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos de Saccharomyces cerevisiae: cuantificación del impacto metabólico. Metab. Ing. 10, 141-153 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lütke-Eversloh, T. & Stephanopoulos, G. Producción de L-tirosina por cepas desreguladas de Escherichia coli. Aplica. Microbiol. Biotecnología. 75, 103-110 (2007).

Artículo PubMed Google Scholar

Chao, YP, Lai, ZJ, Chen, P. & Chern, JT Tasa de conversión mejorada de L-fenilalanina mediante reacciones de acoplamiento de aminotransferasas y fosfoenolpiruvato carboxiquinasa en Escherichia coli K-12. Biotecnología. Prog. 15, 453–458 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Romagnoli, G. y col. La eliminación del gen ARO8 de Saccharomyces cerevisiae, que codifica una transaminasa de aminoácidos aromáticos, mejora la producción de feniletanol a partir de glucosa. Levadura 32, 29–45 (2015).

CAS PubMed Google Académico

Liu, Q. y col. Reconfiguración del metabolismo del carbono en la levadura para una producción de alto nivel de sustancias químicas aromáticas. Nat. Comunitario. 10, 4976 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gu, Y., Ma, J., Zhu, Y., Ding, X. & Xu, P. Ingeniería Yarrowia lipolytica como chasis para la síntesis de novo de cinco productos químicos y productos naturales derivados de aromáticos. Sintetizador ACS. Biol. 9, 2096-2106 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Larroude, M., Onésime, D., Rué, O., Nicaud, JM y Rossignol, T. Una cepa de Yarrowia lipolytica diseñada para la producción de piomelanina. Microorganismos 9, 838 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmaler-Ripcke, J. et al. Producción de piomelanina, un segundo tipo de melanina, a través de la vía de degradación de tirosina en Aspergillus fumigatus. Entorno de aplicaciones. Microbiol 75, 493–503 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Fernández-Cañón, JM & Peñalva, MA Caracterización de un gen de maleilacetoacetato isomerasa fúngica e identificación de su homólogo humano. J. Biol. Química. Rev. 273, 329–337 (1998).

Artículo PubMed Google Scholar

Bassel, J., Hambright, P., Mortimer, R. & Bearden, AJ Mutante de la levadura Saccharomycopsis lipolytica que acumula y excreta protorfirina IX. J. Bacteriol. 123, 118-122 (1975).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barth, G. & Weber, H. Estudios genéticos de la levadura Saccharomycopsis lipolytica. Inactivación y mutagénesis. Z. Allg. Microbiol. 23, 147-157 (1983).

CAS PubMed Google Académico

Tai, M. y Stephanopoulos, G. Ingeniería del empuje y atracción de la biosíntesis de lípidos en levadura oleaginosa Yarrowia lipolytica para la producción de biocombustibles. Metab. Ing. 15, 1–9 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Larroude, M., Rossignol, T., Nicaud, JM y Ledesma-Amaro, R. Herramientas de biología sintética para la ingeniería de Yarrowia lipolytica. Biotecnología. Adv. 36, 2150–2164 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xiong, X. & Chen, S. Ampliación de la caja de herramientas para la expresión de genes de Yarrowia lipolytica para incluir nuevos promotores híbridos, reprimibles e inducibles. Sintetizador ACS. Biol. 9, 2208–2213 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zhao, Y. et al. Estrategias de ingeniería de promotores híbridos en Yarrowia lipolytica: producción de alcohol isoamílico como estudio de prueba. Biotecnología. Biocombustibles 14, 149 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fernández-Cannon, JM et al. Los ratones con deficiencia de maleilacetoacetato isomerasa (MAAI/GSTZ) revelan una derivación no enzimática dependiente de glutatión en el catabolismo de la tirosina. Mol. Biol celular. Rev. 22, 4943–4951 (2002).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Yuzbasheva, EY et al. El portador de citrato mitocondrial en Yarrowia lipolytica: su identificación, caracterización y significado funcional para la producción de ácido cítrico. Metab. Ing. 54, 264–274 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sambrook, J., Fritsch, EF y Maniatis, T. Clonación molecular: manual de laboratorio. (Laboratorio Cold Spring Harbor, 1989). https://books.google.co.uk/books/about/Molecular_Cloning.html?id=8WViPwAACAAJ&redir_esc=y. Consultado el 23 de marzo de 2023.

Gibson, DG y col. Ensamblaje enzimático de moléculas de ADN de hasta varios cientos de kilobases. Nat. Métodos 6, 343–345 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S. y Marillonnet, S. Un sistema de clonación modular para el ensamblaje estandarizado de construcciones multigénicas. PLoS One 6, e16765 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, D. y col. Un sistema de recombinación eficiente para la ingeniería cromosómica en Escherichia coli. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 97, 5978–5983 (2000).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Datsenko, KA & Wanner, BL Inactivación en un solo paso de genes cromosómicos en Escherichia coli K-12 utilizando productos de PCR. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 97, 6640–6645 (2000).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Russell, CB y Dahlquist, FW Intercambio de alelos cromosómicos y plásmidos en Escherichia coli mediante selección por pérdida de un marcador de sensibilidad a antibióticos dominante. J. Bacteriol. 171, 2614–2618 (1989).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shabbir Hussain, M., Gambill, L., Smith, S. y Blenner, MA Ingeniería de arquitectura promotora en levadura oleaginosa Yarrowia lipolytica. Sintetizador ACS. Biol. 5, 213–223 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Borsenberger, V. y col. Múltiples parámetros impulsan la eficiencia de las modificaciones genéticas inducidas por CRISPR/Cas9 en Yarrowia lipolytica. J. Mol. Biol. 430, 4293–4306 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Blazeck, J., Liu, L., Redden, H. y Alper, H. Ajuste de la expresión génica en Yarrowia lipolytica mediante un enfoque de promotor híbrido. Aplica. Reinar. Microbiol 77, 7905–7914 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Agradecemos a Alice Boo por su ayuda con los experimentos del lector de placas y el análisis estadístico, a Martin Todd por su ayuda con la selección de la biblioteca promotora, a Will Newell por la revisión del manuscrito y a David Bell por su apoyo analítico. También nos gustaría agradecer a Eliza Atkinson, Diego Ruiz, Young-Kyoung Park, Razieh Rafieenia, Piotr Hapeta y Mohamed Almarei por brindarnos valiosos comentarios sobre el Manual. Este trabajo fue financiado por Kaesler Nutrition GmbH, el Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC - BB/R01602X/1), BioMediCan Inc. y una subvención federal de la Federación de Rusia según el acuerdo n.º 075-15-2019-1659.

Tigran V. Yuzbashev

Dirección actual: Plant Sciences and the Bioeconomy, Rothamsted Research, West Common, Harpenden, Hertfordshire, AL5 2JQ, Reino Unido

Departamento de Bioingeniería, Imperial College London, Londres, SW7 2AZ, Reino Unido

Tigran V. Yuzbashev, Davina Patel y Rodrigo Ledesma-Amaro

BioMediCan Inc., 40471 Encyclopedia Circle, Fremont, 94538 CA, EE. UU.

Evgeniya Y. Yuzbasheva

NRC 'Instituto Kurchatov'—GosNIIgenetika, Centro Genómico Kurchatov, 1-st Dorozhny Pr., 1, Moscú, 117545, Rusia

Olga E. Melkina y Dmitrii Bubnov

Instituto de Investigación Kaesler, Kaesler Nutrition GmbH, Fischkai 1, 27572, Bremerhaven, Alemania

Heiko Dietz

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TVY y RL-A. concibió el Módulo Exp. TVY y EYY concibieron los módulos Pro, Del, Cas, Int y MEx. TVY y EYY desarrollaron una nueva metodología. RL-A supervisó el trabajo. TVY y OEM diseñaron y ensamblaron la mayoría de las piezas de plásmidos y promotores nativos. HD diseñó los promotores híbridos. TVY y DP realizaron la citometría de flujo y escribieron el manual. TVY y DMB desarrollaron técnicas de recombinación in vivo. TVY escribió la versión inicial del manuscrito. Las versiones posteriores fueron revisadas por RL-A, HDHD y RL-A. concibió el proyecto que apoya la investigación.

Correspondencia a Tigran V. Yuzbashev o Rodrigo Ledesma-Amaro.

Kaesler Nutrition GmbH declara tener intereses competitivos en secuencias de promotores híbridos. Todos los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Communications Biology agradece a Oliver Konzock y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: [Tobias Goris y Anam Akhtar]. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Yuzbashev, TV, Yuzbasheva, EY, Melkina, OE et al. Un conjunto de herramientas de ensamblaje de ADN para desbloquear el potencial de CRISPR/Cas9 para la ingeniería metabólica. Común Biol 6, 858 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05202-5

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Recibido: 26 de marzo de 2023

Aceptado: 01 de agosto de 2023

Publicado: 18 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05202-5

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